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[분자생물학] DNA sub-cloning

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    • 소개글
    [분자생물학] DNA sub-cloning에 대한 자료입니다.
    목차
    1.DNA sub-cloning의 1단계: 원하는 유전자를 분리한다.
    2.DNA sub-cloning의 2단계: 얻은 유전자를 Cloning Vector에 삽입한다.
    3.DNA sub-cloning의 3단계: 유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입한다.
    4.DNA sub-cloning의 4단계: 올바른 clone 을 증폭시킨다.
    본문내용
    DNA sub-cloning의 1단계: 원하는 유전자를 분리한다.

    실험날짜 : 2011.10.24-28
    실험목표 : DNA의 ligation/insertion process를 보고 그 결과를 확인한다. pET-14b vector에 antibiotic resistant 한 gene을 ligation 시키고, 후에 그 DNA를 component cell에 다시 삽입하여 ampicillin을 통해서 제대로 target gene이 삽입되었는지를 관찰하는 것이다

    ▣실험1 [Digestion of DNA with Restriction Enzyme]
    실험준비물 :
    Materials-restriction enzymes (ndeⅠ,BamhⅠ), restriction enzyme reaction buffer, DDW
    Equipments-water bath, brief centrifuge

    Procedure :
    ① e-tube를 두 개 준비하여, 각각 plasmid only와 inserted plasmid를 5μl 넣고, DDW 2μl,10x reaction buffer, 제한효소를 각각 1μl 넣는다. 제한효소를 가장 마지막에 넣는다.
    효소를 보관할 시, 50% glycerol을 써서 보관을 하는데, 이것은 –20도의 온도에서도 얼지 않고 보존될 수 있도록 동결보존제에 넣은 것이다.
    ② pipetting을 기포가 생기지 않도록 주의하면서 천천히 해준다.
    ③ 약 3~5초 간 brief centrifugation을 통해서 tube 바닥에 pellet화 되게 한다
    ④ 37도 water bath에서 1시간동안 반응시킴으로 restriction이 제대로 이뤄지게 한다.
    #분자생물학#DNA#subcloning#cloning#생물학