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[세포생물학] 세포 배양 실험

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    • 소개글
    [세포생물학] 세포 배양 실험에 대한 자료입니다.
    목차
    1.Attached cell culture
    2.Suspension cell culture
    3.Cell proliferation assay (cell viability test, MTS assay)
    4.Growth curve
    5.Accumulative growth curve
    6.Cell proliferation test 결과
    7.Cell line record
    본문내용
    날짜: day 1 (11/15)

    실습명: 세포분양, Media preparation, dilution

    실습 목적:Attached cell culture를 하기 위해 세포를 분양 받는다. 세포를 배양하기 위한 complete media를 제조한 후 cell과 적절하게 dilution하여 suspended cell culture를 시작한다.

    실험에 사용한 도구:DMEM(Eagle’s minimal essential medium)complete media(1% penicillin/streptomycin, 10% Fetal Bovine Serum),cryo media,Haemocytometer, trypan blue,incubator, trypsin/EDTA, pipettes, pipette tips, e-tube, suction (Pasteur pipette), alcohol lamp, petri dish, counter, microscope, water bath, RAW 264.7 (attached cell line), nitrogen tank.

    실험 원리: 농도가 1X107 cells/ml인 Passage number 6인 RAW264.7 cell을 분양 받는다. 분양을 받기 위해서는 nitrogen tank (-196℃)에 얼어있는 RAW cell을 꺼내서 thawing을 해야 한다.Nitrogen tank에 있는 cell들은 Cryo media라는 특수 media를 사용한다. 여기서, cryo media는 complete media(DMEM) +10% FBS + 5% DMSO(Dimethyl sulfoxide(CH3)2SO).여기서 DMSO의 역할은 cryoprotectant의 역할을 한다. 즉, 세포가 천천히 얼게 만들어준다. Thawing을 할 때, water bath를 사용하여 media가 cell에 닿기 전에 따뜻하게 해줘서 cell stress를 최소화 한다. 또한 cell thawing하는 시간을 최소화 하여 cell stress를 최소화 한다.세포를 분양하기 위하여 complete media를 준비한다. 여기서, complete media란 host가 원하는 영양 성분이 대부분 모두 들어가 있는 media이다. 이것의 반대 개념은 incomplete media라고 한다.먼저, DMEM 500ml에 P/S(Penicillin/Streptomycin)를 1% 첨가하기 위하여 5ml를 첨부한다. 1% p/s media 45ml에 heat inactivation된 10% FBS를 55ml첨가하여 complete media를 만든다. 여기서, FBS를 heat inactivation해주는 것은, 불필요한 protein들을 denature시켜서 inactivation시켜주기 위해서이다. 최종적으로 CEM-SS 세포의 농도를 2X105cells/ml로 만들어주기 위해, Passage number 3인 5X105cells/ml 농도의 CEM-SS cell 4ml와 complete media 6ml를 섞는다. Suspension cell culture를 시작하기 위해 이것을 37˚C, 5% CO2에서3일간 incubation시킨다. 여기서 37˚C, 5% CO2에서 incubation하는 이유는, animal cell들이 잘 자라는 온도가 37˚C이고, 5% CO2 또한 animal cell들이 잘 자라는 CO2농도이다기 때문이다.
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