디스크 확산법
분야
hwp디스크 확산법은 검사에 사용되는 배지와 시약 등이 제조회사마다 다르고 같은 회사의 제품이라도 lot에 따라 다소의 차이가 있을 뿐 아니라 시험과정이 수작업에 의존할 수밖에 없어서 검체채취부터 결과판독까지의 전과정에 걸쳐 표준화된 방법의 적용과 이에 대한 정도관리가 이루어져야 하며 최종적인 디스크 확산법의 정도관리는 표준균주 억제대가 허용범위에 드는 가를 측정함으로써 이루어진다.
배지
대부분 Mueller-Hinton agar (MHA)를 사용한다. MHA는 재현성이 좋고, sulfonamide, trimethoprim, tetracycline에 대한 억제 성분이 거의 없으며, 대부분의 병원균이 잘 자라고, 현재까지 MHA를 사용하여 얻은 자료가 많이 축적되어 있기 때문이다. 그러나 Haemophilus는 MHA에 hematin, yeast extract, NAD를 첨가한 Haemophilus test medium (HTM)을 사용하고, Neisseriagonorrhoeae는 성장증식제를 첨가한 GC 배지를 사용하며 Streptococcuspneumoniae와 β-용혈성 연쇄구균은 MHA에 면양혈액을 첨가한 배지를 이용한다.
상품화된 MHA로 평판배지를 만들려면 한천을 멸균시킨 후 45-50℃로 식힌 다음 페트리 접시에 높이가 4 mm가 되도록 붙는다. 디스크 감수성 시험은 배지내의 확산을 이용하므로 배지의 두께를 4 mm로 정확히 맞추어야만 좋은 결과를 얻을 수 있다. 페트리 접시 지름에 따라 150 mm이면 60-70 mL를 넣고 100 mm이면 25-30 mL를 넣는다. 제조한 배지는 실온에서 식힌 후 제조 당일에 사용하지 않을 경우에는 냉장고에 보관하며, 제조후 7일이내에 사용해야 한다. 배지 제조시마다 30-35℃에서 24시간이상 배양하여 무균성을 확인해야 한다. 자동분주기를 사용하면 배지 높이를 정확히 맞출 수 있다.
배지의 pH가 너무 낮으면 aminoglycosides와 macrolides 약물은 역가가 감소할 수 있고 penicillin 등은 역가가 증가할 수 있으며 pH가 높으면 반대 현상이 발생한다. pH 측정은 실온에서 pH electrode로 측정한다. 배지는 사용전에 실온에 꺼내어 습기를 제거한다. 습기가 많을 경우에는 35℃ 배양기나 laminar flow hood에서 배지 뚜껑을 일부 열어 놓은 채로 10-30분간 말린다. 배지 또는 petri 접시 뚜껑에 물방울이 있으면 안된다. MHA 배지의 Mg++과 Ca++농도에 따라 너무 높으면 억제대가 줄어 들고 낮으면 커진다. 특히 Mg++과 Ca++ 농도 변화는 Pseudomonas의 aminoglycoside, tetracycline 및 colistin의 결과에 영향을 줄 수 있다.
시험방법
장내세균, 포도당비발효 그람음성간균, 장구균과 Vibrio cholerae는 증식법 또는 직접법으로 균접종량을 맞추고 포도구균, Haemophilus, N. gonorrhoeae, S. pneumoniae 및 β-용혈성 연쇄구균은 직접법으로 균접종량을 맞춘다.
균접종량을 맞춘 후 15분이내에 면봉으로 균액을 묻힌 다음 균액이 없는 시험관 벽에 대고 돌려서 짜낸다.
충분히 마른 MHA 배지 표면에 균액을 묻힌 면봉을 골고루 획선한다. 획선 방향을 60°씩 회전하여 2번이상 골고루 획선한다.
배지 뚜껑을 3-5분 동안 일부를 열어 놓아 습기가 흡수되도록 하되 15분이상 말리면 안된다.
항균제 디스크를 멸균된 핀셋이나 dispenser를 이용하여 배지표면에 붙인다. 디스크 중앙간의 거리는 24 mm이상 떨어져야 하며 보통 150 mm 접시에는 12개이하, 100 mm 접시에는 5개이하의 디스크를 붙인다. 디스크는 배지 표면에 닿으면 즉시 확산되므로 한번 배지와 접촉했던 디스크는 다시 붙이지 않는다.